Новые пути решения проблемы замещения дефектов при обширной резекции у животных с опухолями костей

11 октября 2013

Е.А. Корнюшенков1,2, Л.В. Голуб1,2, Н.Ю. Анисимова1, М.В. Киселевский1, Н.А. Глазов1,2, А.В. Максимкин3, А.Л. Кузнецова1,2, А.А. Шимширт1,2, Д.Е. Митрушкин1,2, Э.Р. Мусаев1, Е.А. Сушенцов1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» РАМН (Москва).
2 Ветеринарная клиника «Биоконтроль» (Москва).
3 Национальный исследовательский технологический университет «Московский Институт Стали и Сплавов» (Москва).

Ключевые слова: биоимплантат, опухоли костей, остеосаркома, реконструктивная хирургия
Сокращения: в/в внутривенно, КТ компьютерная томография, ММСК мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, ОС остеосаркома, СОД суммарная очаговая доза

На базе ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН был разработан метод получения имплантатов для замещения обширных дефектов костной ткани с использованием деиммунизированной донорской кости, реколонизированной мезенхимальными стромальными клетками реципиента. Целью проведенных исследований являлись: оценка прочности в сравнении с интактной костью, биодеструкции образцов биоимплантатов после гетеротопной трансплантации и изучение возможности их использования для замещения расширенных дефектов после резекции неопластически измененной костной ткани у животных со спонтанными опухолями. Полученные результаты показали отсутствие развития острого отторжения биоимплантата организмом реципиента, биодеструкции матрикса и ухудшения его механических свойств в сравнении с исходной костью. В то же время наблюдаются признаки васкуляризации ткани биоимплантата и его реколонизация клетками реципиента. Исследования, проведенные на базе клиники экспериментальной терапии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН с ветеринарной клиникой «Биоконтроль», показали возможность эффективного использования данного подхода в реконструктивной хирургии для замещения дефекта после резекции кости. В послеоперационном периоде наблюдали восстановление опорных функций конечностей животных, быструю консолидацию имплантата в области остеотомии на фоне отсутствия признаков развития реакции острого отторжения.

Введение

Проблема замещения дефектов после расширенных хирургических вмешательств чрезвычайно актуальна в современной медицинской и ветеринарной онкологии. У онкологических больных потребность в замещении костных фрагментов возникает как вследствие деструкции тканей в результате опухолевого процесса, так и после расширенных хирургических вмешательств, предполагающих резекцию измененных участков.

Использование протезов для замещения дефектов нашло широкое применение в травматологии и ортопедии, а также у онкологических больных с опухолями костей. В различные периоды развития хирургии для изготовления протезов, предназначенных для замещения дефектов кости, использовали разные материалы.

Металлические протезы. В медицине человека широко используют металлические имплантаты. Отечественные ученые для замещения костных дефектов предложили имплантаты на основе титана и его сплавов (никелида титан, титан-тантал-ниобий, титан-кобальд) с нанесенным на него биосовместимым кальций-фосфатным покрытием, обеспечивающим адгезию клеток [2]. Недостаток такого имплантата опасность его повреждения в зонах крепления к кости из-за различной плотности соприкасающихся поверхностей.

Однако эффективность эндопротезирования нередко нивелируется последующими осложнениями [4, 7], к основным причинам которых относят: инфекционные процессы в ложе эндопротеза, асептическую нестабильность, перелом конструкции эндопротеза и износ его полиэтиленовых вкладышей.

Биокерамические протезы. Принцип получения биоинженерных конструкций, предназначенных для замещения костных дефектов, заключается в следующем: пористые матриксы из гранулированных биокерамических материалов (на основе гидроксиапатита) или из натуральных кораллов Acropora sp., Porites sp. насыщают культурой аутологичных мультипотентных клеток, выделенных из костного мозга [2, 6]. Однако указанные протезы имеют серьезные недостатки. В частности, биокерамические материалы в организме плохо рассасываются, и их остатки оказываются замурованными в костную ткань, что делает ее менее прочной [2]. Кроме того, керамику на основе гидроксиапатита можно использовать только для замещения участков костей, не несущих значительных механических нагрузок, что обусловлено хрупкостью материала и его высокой чувствительностью к коррозии в физиологических жидкостях организма, приводящей к разрушению имплантата [2]. Высокая порозность естественных кораллов обусловливает хрупкость материала. По этой причине биоконструкции рекомендовано использовать либо для восстановления дефектов губчатой костной ткани, либо в сочетании с металлическими пластинами, несущими опорную функцию [6].

Следует отметить, что в ветеринарной практике данная тактика практически не применима в связи с тем, что протезы должны изготавливаться индивидуально, а это увеличивает их и без того высокую стоимость, а также из-за локализации опухолей костей (чаще в дистальном отделе лучевой или бедренной кости, проксимальном отделе плечевой кости), затрудняющей постановку протеза [3, 5].

Аутотрансплантаты. В разные годы в медицине и ветеринарии для замещения костных дефектов использовали собственную костную ткань пациента после специальной подготовки (обработка жидким азотом, облучение фрагмента кости при ОС, замораживание или вываривание кости) [3, 5, 8]. Тем самым были достигнуты основные цели: удаление опухоли и сохранение каркасных свойств кости. Однако в процессе обработки кость не успевает «перестраиваться», что влечет за собой развитие септических осложнений [3, 5].

Для преодоления описанных недостатков было предложено изготавливать пластический материал на основе донорской кости [6]. Этот способ предусматривает деиммунизацию донорской кости, включающую в себя несколько этапов. Донорскую кость предварительно распиливают на блоки размером 321 см, делают сквозные отверстия диаметром от 0,1 мм (до 10 мм в каждой плоскости блока, не менее одного отверстия на 1 см2), обрабатывают смесью ферментов (0,1…1%-й раствор трипсина и 0,125…0,3%-й раствор папаина в соотношении 1:1). Затем блоки отмывают в смеси 1%-го раствора пероксида водорода и 1%-го раствора этанола (соотношение 1:1), и заполняют каждое отверстие блока материалом, состоящим из солей двух и/или трехвалентных металлов, коллагена, алкил-, карбоксилалкил- или гидроксиалкилпроизводных целлюлозы, сульфатированных гликозаминогликанов и воды, после чего костный блок замораживают, лиофилизируют и стерилизуют облучением. Однако полученный имплантат можно использовать для замещения только небольших по площади (не более 321 см) костных дефектов, что ограничивает его применение областью стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Кроме того, процесс фиксации и репарации имплантата в организме реципиента занимает достаточно много времени.

Таким образом, чтобы обеспечить запросы практической хирургии, необходимы биоинженерные конструкции, пригодные для замещения значительных по площади костных дефектов, характеризующиеся следующими свойствами: сохранение физических и анатомических особенностей донорской кости, высокая прочность, быстрая фиксация в зоне имплантации и репарация тканью реципиента, отсутствие реакции отторжения имплантата.

Биоимплантаты. Это трупные органы, которые были обработаны по оригинальной методике, предложенной сотрудниками лаборатории клеточного иммунитета ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН [1]. В отличие от аналогичных разработок, данная методика позволяет в короткие сроки получить пластический материал, способный выполнять каркасные и опорные функции. На его основе может быть создан индивидуальный биосовместимый имплантат, матрикс которого перед трансплантацией заселяют низкодифференцированными мезенхимальными клетками реципиента, что призвано ускорить реваскуляризацию биоимплантата.

Цель исследования

Изучить механические свойства и биосовместимость имплантатов, полученных в соответствии с оригинальной методикой, разработанной на базе ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН.

Материалы и методы

Исследования были выполнены на базе Клиники экспериментальной терапии НИИ Клинической онкологии совместно с лабораторией клеточного иммунитета НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей и отделением общей онкологии НИИ КО «ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. В течение 20112013 гг. были проведены экспериментальные операции по ортотопической трансплантации биоимплантатов костей.

Исследования на животных (5 собак и одна кошка) включали в себя два этапа: на первом изучали биодеструкцию образцов биоимплантатов после гетеротопной трансплантации, на втором возможность использования биоимплантатов для замещения расширенных дефектов после резекции неопластически измененной костной ткани у животных со спонтанными опухолями.

Подготовка биоимплантатов. Кости взрослых животных, подвергнутых эвтаназии вследствие полученных травм, несовместимых с жизнью, после механической очистки от мягких тканей были деиммунизированы в 5…10%-м растворе, приготовленном из сухой смеси хлорита натрия, перхлората натрия, хлорида натрия в соотношении 7:2:1 и дистиллированной воды; покрыты гетерогенным имплантируемым гелем и колонизированы ММСК, выделенными из костного мозга реципиента [заявка на патент РФ № 201212088/15(031567)].

Механические свойства биоимплантатов изучали по показателям «предел текучести», «модуль упругости» и «предел прочности» в соответствии с ГОСТ 4651-82 на участке деформационной кривой от 10 до 30 МПа. Использовали плечевые кости 5 взрослых собак (средний возраст 9±1,2 года), изъятых в процессе аутопсии, а для сравнительного анализа диафизарные фрагменты костей цилиндрической формы высотой 20 мм. Подготовленные фрагменты костей разделили на две группы контрольную и опытную. Образцы контрольной группы хранили до начала исследования в растворе для криоконсервации, состоящем из диметилсульфорсида (ПанЭко, РФ) и 6%-го раствора полиглюкина (Красфаорма, РФ) в соотношении 1:9. Образцы опытной группы использовали как основу для получения биоимплантатов указанным выше способом. Испытания на сжатие проводили на универсальной испытательной машине Zwick/Roell z020 в соответствии с методикой, отработанной нами ранее [1].

Исследование биосовместимости и биодеструкции биоимплантатов. На первом этапе наблюдали, возникает ли реакция острого отторжения, и изучали признаки биодеструкции имплантатов после их гетеротопной трансплантации в бедренную складку здоровых беспородных собак (n=3). Исследуемые образцы представляли собой биоимплантаты на основе фрагментов диафизарного отдела лучевой кости длиной 2,8 см и диаметром 1,2 см. Срок имплантации 2 мес.

Во второй серии экспериментов биоимплантаты использовали для замещения дефекта после резекции кости. Основные этапы:

1. Заселение деиммунизированных трубчатых костей и костей таза ММСК реципиента (n=6).
2. Трансплантация: после резекции костей таза (рис. 1), длина резекции 5 см (n=2); предплечья (рис. 2), длина резекции от 6 до 12 см (n=3); большеберцовой кости (рис. 3), длина резекции 6 см (n=1).

Для обработки первичных данных и статистического анализа использовали специализированную аналитическую программу testXpert II. Результаты механических испытаний на сжатие образцов контрольной группы и биоимплантатов представлены как среднее арифметическое ± среднеквадратичное отклонение.

Рис. 2. Широкая сегментарная резекция локтевой кости у собаки по поводу ОС (длина резекции 9 см)

Рис. 3. Широкая сегментарная резекция большеберцовой кости у кошки с хондросаркомой

Результаты и обсуждение

Исследование механических свойств имплантатов. Оценили влияние химической обработки кости (с целью деиммунизации матрикса имплантата) на прочностные характеристики пластического материала. В качестве объектов сравнения использовали фрагменты костей того же генеза. Достоверных различий по изучаемым параметрам между образцами контрольной и опытной группы не отмечено (р>0,05), то есть примененный метод обработки биоимплантата не ухудшает его механических свойств.

Исследование биосовместимости имплантатов. Подготовленные образцы биоимплантатов имплантировали в паховую складку здоровых собак сроком на 2 мес. Послеоперационный период протекал гладко, без признаков развития местного или системного воспалительного процесса. После извлечения образцы были подвергнуты патолого-анатомическому исследованию, при котором не выявлено видимых признаков биодеструкции имплантата. Структура межклеточного компактного костного вещества и костномозговых балок сохранена. Скоплений иммунокомпетентных клеток в тканях, прилегающих к поверхности имплантата, не обнаружено. На поверхности образцов отмечали наличие сформированной соединительнотканной капсулы. На срезах костномозгового канала были обнаружены признаки реколонизации имплантата клетками реципиента с формированием полноценных кровеносных сосудов.

Таким образом, исследования, проведенные на предварительном этапе, показали, что острое отторжение биоимплантата организмом реципиента и биодеструкция матрикса отсутствуют, а по своим механическим свойствам имплантант не уступает исходной кости. В то же время отмечены признаки васкуляризации ткани биоимплатата и его реколонизация клетками реципиента.

Ортотопическая трансплантация. У животного, которому трансплантировали подвздошную кость, биоимплантат удалили на 167-е сутки (рис. 6 а, б). На 40-е сутки при КТ (рис. 6 в, г) наблюдали признаки консолидации. В период наблюдения опороспособность у животного составляла 100 %. При гистологическом исследовании биоимплантата отмечено: костный трансплантат с признаками атрофии костных балок; реакция отторжения отсутствует (рис. 6 д). У животного с резекцией локтевой кости (участок длиной 6 см) и замещением смоделированного дефекта биоимплантатом время наблюдения составило, на момент написания статьи, 175 дней. На 48-е сутки, по данным рентгенографии, отмечены признаки консолидации в пароксимальной и дистальной части в зоне остеотомии (рис. 7 а). На 105-е сутки животному была выполнена ангиография, по результатам которой визуализировали зону повышенной реваскуляризации в зоне биоимплантата (рис. 7 б). Опороспособность на оперируемую конечность с первого дня операции составила 100 %.

Рис. 6. Биоимплантат в области крыла подвздошной кости таза: а макрофото на 168-е сутки перед извлечением; б макрофото после извлечения; в и г данные КТ на 40-е сутки: 3D реконструкция (в) и аксиальная проекция (г); д гистологическая картина биоимплантата после ортотопической трансплантации, окраска гематоксилином и эозином, 900

Рис. 7. Экспериментально смоделированный дефект локтевой кости и замещение дефекта с помощью биоимплантата: а рентгенограмма на 48-е сутки после ортотопической трансплантации локтевой кости, признаки консолидации в зоне проксимального участка остеотомии (стрелка); б ангиограмма, зоны повышенной васкуляризации в области биоимплантата

Клинический случай 1. На прием в клинику экспериментальной терапии НИИ КО «ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН с ветеринарной клиникой «Биоконтроль» из другого лечебного учреждения поступил кот, европейский короткошерстный, 10 лет, с диагнозом опухоль кости. После комплексного исследования животному был поставлен диагноз: хондросаркома проксимального отдела большеберцовой кости, II стадия. 10.02.2013 г. была выполнена широкая сегментарная резекция кости (7 см, или 60 % длинны всей кости) с ортотопической трансплантацией ксенобиоимплантата, артродез коленного сустава (рис. 8 а, б). Опороспособность на оперируемую конечность на следующие сутки после операции оценили на 30 %. К моменту снятия швов, на 21-е сутки, опороспособность достигла 50 %. Через 45 дней при контрольном рентгенографическом исследовании мы определяли зоны консолидации в области остеотомии, удостоверились в правильном положении ксенобиоимплантата и пластины. Опороспособность на оперируемую конечность 80 %, постановка конечности правильная (рис. 8 в). Животное самостоятельно забирается на диван, играет. Время наблюдения на момент написания статьи 120 дней. Из осложнений мы отмечали кожный дефект размером до 2 см в проксимальной части большеберцовой кости. В связи с длительным заживлением животному выполнена пластика дефекта кожным лоскутом на ножке.

Рис. 8. Ортотопическая трансплантация большеберцовой кости у кота с хондросаркомой: а интраоперационный вид; б рентгенограмма после операции; в пациент на 45-е сутки после трансплантации

Клинический случай 2. Собака породы американский бульдог, 7 лет, самка. Диагноз: ОС диафизарного сегмента локтевой кости, II b стадия. Животному в предоперационном периоде назначены 2 курса в/в химиотерапии цисплатином 60 мг/м2, лучевая терапия СОД=30 Гр. В последующем проведена широкая сегментарная резекция кости (12 см, или 60 % всей длины кости) с замещением дефекта биоимплантатом (рис. 9 а, б, в, г). Опороспособность на оперируемую конечность в 1-е сутки оценили на 80 %, отмечена хромота опирающегося типа. На 7-е сутки животное выписано из стационара в удовлетворительном состоянии, опороспособность составила 100 %. На 14-е сутки животное вновь поступило в клинику, повод отсутствие опороспособности на оперируемую конечность, отек конечности. При клиническом осмотре определили патологическую подвижность, при рентгенографическом исследовании выявили перелом материнской кости в проксимальном отделе, смещение пластины и биоимплантата. После серии реопераций животное было выведено из эксперимента.

Рис. 9. Собака, американский бульдог, 7 лет, ОС диафизарного сегмента локтевой кости: а рентгенограмма до операции; б интрооперационный вид; в рентгенограмма после ортотопической трансплантации, г пациент на 1-е сутки после трансплантации

Клинический случай 3. Собака породы боксер, 8 лет. Диагноз: ОС диафизарного сегмента локтевой кости, стадия II b (рис. 10 а). Животному выполнена широкая сегментарная резекция кости (9 см, или 60 % длинны всей кости) с замещением дефекта биоимплантатом (рис. 10 б, в). Имея негативный опыт с фиксацией локтевой кости, мы дополнительно выполнили иммобилизацию с помощью лангеты, а также фиксировали с пластиной лучевую и локтевую кости. На момент написания статьи (2 мес) опороспособность на оперируемую конечность составила 100 %, животное проходит курс химиотерапии.

Выводы

На основании проведенных исследований можно говорить, что применение биоимплантатов с целью замещения дефектов при резекции костей имеет большие перспективы. В дальнейшем мы планируем выполнить ряд реконструктивных операций у животных со спонтанными опухолями костей, провести статистический анализ и дать объективную оценку полученных результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ГК 14.512.11.0005)

Библиография

1. Анисимова Н.Ю., Максимкин А.Б., Копылов А.Н., Корнюшенков Е.А., Митрушкин Д.Е., Киселевский М.В. Опыт исследования механических свойств трубчатых костей собак // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи, 2012; 4:5358.
2. Баринов С.М. Керамические и композиционные материалы на основе фосфатов кальция для медицины // Успехи химии, 2010; 79: 1532.
3. Гаранин Д.В. Использование экстракорпорально облученных реплантатов кости для сохранных операций при спонтанных злокачественных опухолях костей у собак: автореф. дис…канд. биол. наук. М., 2007.
4. Кирильчик А.А., Иванов В.Е., Стародубцев А.Л., Зубарев А.Л., Киричук С.В., Киселева М.В., Карпейкина М.М., Малинова И.В. Реабилитация онкологических больных после эндопротезирования крупных суставов // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи, 2012; 3: 1015.
5. Митин В.Н. Сравнительные результаты различных методов лечения остеосаркомы длинных трубчатых костей у собак: автореф. дис… докт. биол. наук. М., 2003.
6. Сергеева Н.С., Франк Г.А., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Антохин А.И. Роль аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в ткани инженерных конструкциях на основе натуральных кораллов и синтетических биоматериалов при замещении костных дефектов у животных // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2009; 4: 5662.
7. Трапезников Н.Н., Амирасланов А.Т., Стефанков С.В. Ошибки и осложнения при эндопротезировании у больных с опухолями костей // Вестник ОНЦ РАМН, 1994; 2: 8285.
8. Matthiesen D.T., Clark G.N., Orsher R.J., Pardo A.O., Glennon J., Patnaik A.K. En bloc resection of primary rib tumors in 40 dogs // Vet Surg; 2001, 21 (3): 201204.

Summary

Kornyushenkov E.A., Golub L.V., Glazov N.A., Anisimova N.Yu., Kisilevsky M.V., Maximkin A.V., Kuznetcova A.L., Shimshirt A.A., Mitrushkin D.E., Musaev E.R., Sushencov E.A. New methods for solving the problem of defect replacement in case of extensive resection of bone tumors in animals. In the FSBI «N.N. Blokhin RСКС» RAMS new method has been developed to create implants for replacement of large bone defects on the basis of deimmunized donor bone recolonized by recipient mesenchymal stromal cells. The aim of the research was the evaluation of the implant strength characteristics in comparison with the intact bone, the biodegradation of implants after the heterotopic transplantation, as well as the study of the possibility to use the implants for the replacement of extended defects after resection of the part of the bone from animals with spontaneous tumors. According to the results obtained no acute bioimplant rejection occured,degradation of the matrix structure was not observed, and mechanical properties of the implant were quite comparible with the intact bone. At the same time there were signs of the vascularization of bioimplant tissue and its recolonization by recipient cells. Studies that had been done in the veterinary clinic «Biocontrol» showed the possibility of the effective use of this approach in the reconstructive surgery for replacement of the defect after bone resection. In the postoperative period there was the recovery of support functions, fast consolidation of the implant in osteotomy area without any signs of the acute rejection reaction.